發(fā)布時(shí)間:2021-12-30 15:06:21
Ames鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變試驗(yàn)-ISO 10993-3, GB/T 16886.3, YY/T 0127.10
Ames試驗(yàn)全稱鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮希?/span>
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella
typhimurium)的組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his-)菌株,在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中,除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外,一般只能分裂幾次,形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后,大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變,自行合成組氨酸,發(fā)育成肉眼可見的菌落。某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用,在測試系統(tǒng)中加入哺乳動(dòng)物微粒體酶,可彌補(bǔ)體外試驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 16886.3 , ISO 10993-3 , ISO/TR 10993-33 , ISO 7405 , YY/T 0870.1 , YY/T 0127.10
Ames試驗(yàn)的常規(guī)方法有斑點(diǎn)試驗(yàn)和平板摻入試驗(yàn)。
1.菌株鑒定
用于測試的菌株,需經(jīng)基因型和生物學(xué)性狀鑒定,符合要求才能投入使用。
目前推薦使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鑒定前先進(jìn)行增菌培養(yǎng)。為鑒定結(jié)果可靠,需同時(shí)培養(yǎng)野生型TV菌株,作為測試菌基因型之對照。增菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,接種后于37℃,100r/min振蕩培養(yǎng)12h左右,細(xì)菌生長相為對數(shù)期末,含菌數(shù)應(yīng)為1×109個(gè)/ml~2×109個(gè)/ml。
鑒定項(xiàng)目:
(1)脂多糖屏障丟失(rfa)用接種環(huán)或一端撓起的接種針以無菌操作術(shù)取各菌株的增菌培養(yǎng)液,在營養(yǎng)瓊脂平板上分別劃平行線,然后用滅菌尖頭鑷夾取滅菌濾紙條,浸濕結(jié)晶紫溶液,貼放在平板上與各接種平行線垂直相交。蓋好皿蓋后倒置于37t溫箱,培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
(2)R因子 劃線接種,貼放濾紙條及培養(yǎng)等均同上,唯濾紙條浸濕的藥液不同,為氨芐青霉素鈉溶液。TA102除pKM101外,還有pAQ1,載有抗四環(huán)素的基因,故另用濾紙條浸濕四環(huán)素溶液后貼放于劃線接種的平板上。
(3)紫外線損傷修復(fù)缺陷(△uvrB)在營養(yǎng)瓊脂平板上按上述方法劃線接種后,一半接種線用黑玻璃遮蓋,另一半暴露于紫外光下8sec,然后蓋好皿蓋并用黑紙包裹平皿,防止可見光修復(fù)作用。培養(yǎng)同上。
(4)自發(fā)回變 預(yù)先制備底平板;向滅菌并在水浴內(nèi)保溫45℃的上層軟瓊脂中注入0.1ml菌液;混勻后傾于底平板上并鋪平。平皿倒置于37℃溫箱培養(yǎng)48h。
(5)回變特性——診斷性試驗(yàn) 上層軟瓊脂中除菌液外,還注入已知陽性物之溶液,需活化系統(tǒng)者并加入S9mix,余同上。
組氨酸營養(yǎng)缺陷型由自發(fā)回變即可知。
2.斑點(diǎn)試驗(yàn)
吸取測試菌增菌培養(yǎng)后的菌液0.1ml,注入融化并保溫45℃左右的上層軟瓊脂中,需S9活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix,立即混勻,傾于底平板上,鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣,紙片浸濕受試物溶液,或直接取固態(tài)受試物,貼放于上層培養(yǎng)基的表面。同時(shí)做溶劑對照和陽性對照,分別貼放于平板上相應(yīng)位置。平皿倒置于37℃溫箱培養(yǎng)48h。在紙片外圍長出密集菌落圈,為陽性;菌落散布,密度與自發(fā)回變相似,為陰性。
3.平板摻入試驗(yàn)
將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中,需代謝活化的再加0.3ml-0.4ml
S9mix,混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時(shí)做陰性和陽性對照,每種處理做3個(gè)平行。試樣通常設(shè)4個(gè)~5個(gè)劑量。選擇劑量范圍開始應(yīng)大些,有陽性或可疑陽性結(jié)果時(shí),再在較窄的劑量范圍內(nèi)確定劑量反應(yīng)關(guān)系。培養(yǎng)同上。同一劑量各皿回變菌落均數(shù)與各陰性對照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比,為致變比(MR)。MR值≥2,且有劑量-反應(yīng)關(guān)系,背景正常,則判為致突變陽性。
送樣要求
ISO 10993-3標(biāo)準(zhǔn):固體或粉末狀: 3個(gè)完整樣品,每個(gè)樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學(xué)品:15ml及以上
GB/T 16886.3標(biāo)準(zhǔn):固體或粉末狀: 3個(gè)完整樣品,每個(gè)樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學(xué)品:15ml及以上
YY/T 0127.10標(biāo)準(zhǔn): 固體或粉末狀: 3個(gè)完整樣品,每個(gè)樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學(xué)品:15ml及以上